质粒DNA纯化步骤，您还不知道吗

更新时间：2020-12-01

浏览次数：837

　　质粒DNA纯化步骤，您还不知道吗

　　DNA纯化和提取是法医DNA物证鉴定的关键技术之一。质粒是一种小环DNA。在基因工程中，质粒常被用作载体，将靶基因转移到受体细胞中。虽然近年来发展了许多更*的基因转移载体（如慢病毒载体、腺病毒载体、AAV载体等），但质粒载体由于其制备简单、在各种细胞中的高效性，仍被大多数实验室所使用。

　　大量提取的质粒DNA需要进一步纯化，常用柱层析法和氯化铯梯度离心法。所有的纯化方法通常都使用两种性质，即相对较小的质粒DNA和共价闭环。例如，用氯化铯进行质粒和染色体DNA的梯度平衡离心，取决于溴化乙锭与线性和闭环DNA分子之间的结合量。

　　质粒DNA纯化步骤如下：

　　1、用无菌牙签选择平板上的单个菌落，接种于含有相应抗生素的3ml-LB培养基中，在37℃下于220rpm振动台上培养过夜。

　　2、将1.5mL过夜培养的菌液转移至Eppendorf离心管内，12000rpm离心30秒，弃上清。

　　3、加入100ul预冷的溶液Ⅰ，充分振荡以悬浮沉淀，冰浴5分钟。

　　4、加入200ul新鲜配制的溶液Ⅱ，轻轻颠倒5次混匀，使溶液澄清，冰浴放置5分钟。

　　5、加入150ul预冷的溶液III，轻微振荡均匀，冰浴5分钟。

　　6、12000rpm离心10分钟，转移上清至另一个灭菌Eppendorf管中。

　　7、加入等体积录仿：异戊醇（体积比24:1），混匀，以12000rpm离心10分钟，取上层水相至另一个灭菌的Eppendorf试管中。注意，不采用低相溶液。

　　8、加入两倍体积的冰乙醇，混匀，在-20℃沉淀15分钟，以12000rpm离心10分钟收集沉淀。

　　9、加70%乙醇1ml洗涤一次，12000rpm离心10分钟，弃去，室温干燥，加50ul Te溶解核酸，备用。

　　好了，以上便是关于质粒DNA纯化的相关内容介绍了。